An Enzyme Transfers the Intact Oligosaccharides
Endo-Mは，山本らが糸状菌Mucor hiemalisの培養液より見出したエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼで，糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖のジアセチルキトビオース結合を加水分解し，タンパク質側にN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)1残基を残して糖鎖を遊離させます。その際，適当な受容体が存在すると遊離した糖鎖がその受容体に転移します1)。Endo-Mは従来から知られているEndo-β-GlcNAc-aseと異なり，高マンノース型糖鎖，混成型糖鎖のみならず複合型糖鎖にも作用する基質特異性の広い酵素で，適当な受容体に糖鎖を転移させることができることから多方面での応用が期待されています。
山本らはGlcNAcの存在下，アシアロトランスフェリン糖ペプチドにEndo-Mを作用させ，生じたオリゴ糖をピリジルアミノ(PA)化した後，HPLCで分析して2種類のPA-オリゴ糖を確認しています2)。一方は加水分解により遊離したオリゴ糖で，もう一方は遊離したオリゴ糖がGlcNAcに転移したオリゴ糖です。受容体としてはジアセチルキトビオース，ダンシルアスパラギル-N-アセチルグルコサミン[DNS-Asn(GlcNAc)]なども有効であることが示されています。また，高マンノース型糖鎖もジアセチルキトビオースに転移できることを確認しています。
羽田らはシアロトランスフェリン糖ペプチド，アシアロトランスフェリン糖ペプチド，高マンノース型糖鎖を有するペプチドにEndo-Mを作用させ，9-フルオレニルメトキシカルボニルアスパラギニル-N-アセチルグルコサミン[Fmoc-Asn(GlcNAc)]に糖鎖を転移させています3)。また，稲津らの開発した方法によりヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)の部分ペプチドhCG(β12-16)にGlcNAcを導入したペプチドを合成し，これにシアロ複合型糖鎖を転移させています。稲津らの開発した方法は，N末をFmocで保護したアスパラギン酸とGlcNAcのアジドから合成されるFmoc-Asn(GlcNAc)をFmoc-Asn-OHの代わりに使用し，ジメチルチオホスフィン酸混合酸無水物(Mpt-MA)法を用いるもので，GlcNAcを有する人工ペプチドの簡便な合成法といえます4)。この方法とEndo-Mを組み合わせることにより，糖鎖ペプチドを自由に設計し，調製することができます。この方法は，化学－酵素合成法として，山本の総説にまとめられています5)。また，Endo-Mは，本来糖鎖を持たない物質に糖鎖を導入し，新たな機能の発現にも利用されています6)。
弊社製品を用いた具体的な例として、下図に示すように受容体糖鎖に転移反応を行い，ビオチンやアジドエチル基の導入された11糖を合成することも可能です。
| A1651 | endo-beta-N-Acetylglucosaminidase (=Endo-M) Recombinant: from Mucor hiemalis expressed in Candida boidinii [Purity: single band by SDS-PAGE(85KDa)] |
*1 unitは，pH6.0，37℃において，Fmoc-SGNに作用させた時，1分間あたりに1 μmolのFmoc-Asn(GlcNAc)を生じる酵素量。
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山本らは乳酸菌Bifidobacterium longumを培養し，その培養液中にエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの存在を見い出し，精製単離しています7)。この酵素はEndo-αと称し，Galβ1-3GalNAcの二糖が水酸基とα結合した構造を認識し，この結合を加水分解しGalβ1-3GalNAcを遊離させます。その際，水酸基を有する化合物を受容体として共存させると遊離したGalβ1-3GalNAcがその受容体に転移します8)。この山本らの見い出したEndo-αは，ムチン型糖鎖に含まれるコア1をドナーとして，糖やペプチド･タンパク質など幅広い化合物にGalβ1-3GalNAcを転移させることができます。
芦田らはEndo-αを用いた糖鎖転移反応を報告しています8a)。それによると，pH5.0酢酸ナトリウム緩衝液中，Galβ1-3GalNAcα-pNPにEndo-αを作用させ，生じたGalβ1-3GalNAcを単糖(グルコース，ガラクトース，マンノース)，二糖(マルトース，スクロース)，糖アルコール(マンニトール，ソルビトール)に転移させています。
このように，Endo-MとEndo-αを使い分けることによって，N-結合型糖鎖およびO-結合型糖鎖両方について転移させることが可能で，酵素法による複合糖鎖合成のツールとして多方面での応用が期待されています。
| A1844 | endo-alpha-N-Acetylgalactosaminidase (=Endo-alpha) Recombinant: from Bifidobacterium longum expressed in Escherichia coli |
*1 unitは，pH5.0，37℃において，Galβ1-3GalNAcα-pNPに作用させた時，1分間あたりに1μmolのGalβ1-3GalNAcとpNPを生じる酵素量。
これらの酵素はNEDOプロジェクトの成果として製品化されました。
Endo-Mはタカラバイオ株式会社，麒麟麦酒株式会社所有の特許を利用しています。
文献
2) K. Yamamoto, S. Kadowaki, J. Watanabe, H. Kumagai, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 203, 244 [DOI].
3) K. Haneda, T. Inazu, K. Yamamoto, H. Kumagai, Y. Nakahara, A. Kobata, Carbohydr. Res. 1996, 292, 61 [DOI].
4) M. Mizuno, I. Muramoto, T. Kawakami, M. Seike, S. Aimoto, K. Haneda, T. Inazu, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 55 [DOI].
5) K. Yamamoto, J. Biosci. Bioeng. 2001, 92, 493 [DOI].
6) S. Kojima, T. Hasegawa, T. Yonemura, K. Sasaki, K. Yamamoto, Y. Makimura, T. Takahashi, T. Suzuki, Y. Suzuki, K. Kobayashi, Chem. Commun. 2003, 1250 [DOI].
7) K. Fujita, F. Oura, N. Nagamine, T. Katayama, J. Hiratake, K. Sakata, H. Kumagai, K. Yamamoto, J. Biol. Chem. 2005, 280, 37415 [DOI].
8a) H. Ashida, K. Yamamoto, T. Murata, T. Usui, H. Kumagai, Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373, 394 [DOI]; b) T. Katayama, K. Fujita, K. Yamamoto, J. Biosci. Bioeng. 2005, 99, 457 [DOI].
kdjoad0000000rdm
